一、标准编号及标准名称
由中国国际科技促进会归口管理、浙江树人学院提出的《基于卤虫无节幼体的纳米塑料水生毒性测定方法》(T/CI582-2024)团体标准，于2024年12月24日正式发布实施。
二、标准制定背景
随着污染防治攻坚战深入推进，具有长期、隐形高风险的新污染物(Contaminants of Emerging Concern，CECs)成为了制约当前环境质量持续改善的新问题和新挑战。2022年5月初，国务院办公厅印发《新污染物治理行动方案》及国家发展改革委《“十四五”塑料污染治理行动方案》强调重视完善新污染物治理体系，进一步加强微塑料污染物全链条治理。水环境中的CECs来源复杂，种类繁多，地球化学行为独特，具有生物毒性、环境持久性和生物累积性等特征，对生态系统和人体健康构成潜在威胁，生态环境风险高，是国际关注的重大环境问题之一，也是当前亟待妥善解决的突出环境问题。环境基准是制定环境标准的科学依据，是生态环境质量评估和风险管控的科学基础，是多学科交叉和国际科学前沿领域。但CECs水质基准领域仍存在很大的认知空白，已成为CECs环境标准制修订和环境保护工作的瓶颈，亟需开展研究，促进环境地球科学发展，为清洁美丽中国和健康中国建设提供有力的科技支撑。
三、标准制定的必要性
自2004年Thompson等在Science杂志定义了“微塑料”一词，并描述了其潜在的生态威胁，引起了全球范围内对这一CECs中占比最高的污染物问题的关注。微塑料直径一般小于5 mm，一般分为两类：一类是为执行某些功能而制造的初级微塑料，如用作工业原料的化妆品微塑料和树脂颗粒;另一类是通过物理、化学和生物过程将大颗粒塑料废物破碎并减少体积而形成的次级微塑料。随着微塑料在人为和自然条件下的进一步分解和降解，它们可能会变得越来越小，最终形成纳米塑料(粒径在1~100 nm)。由于其极小的尺寸和大比表面积，纳米塑料具有与传统微塑料不同的物理、化学和生物学特性，它们比普通的塑料颗粒及微塑料更容易被生物吞噬，并进入生物体内。随着人造纳米材料(manufactured nanoplastics，MNP)在消费品和其他产品中的开发和使用越来越多，纳米塑料在自然界中广泛存在，并已被发现通过直接或间接的方式进入水生生态系统和陆地生态系统，造成了生态风险。
现阶段，中国作为世界最大的塑料生产和消费国，针对纳米塑料的生态风险评估的方法，一般采用普遍纳米材料的评估方法，如GB/T 1032-2013《纳米技术 纳米材料风险评估》中规定的基于已有文献的“证据权衡法”进行评估，缺乏针对性验证。然而受制于CECs中纳米塑料的物理惰性和文献局限性，上述方法难以在基础实验中具体实现。同时，由于纳米塑料的生态风险因其主要成分及粒径形态不同而发生改变，因此非常有必要聚焦水环境中纳米塑料的毒性效应，发展建立基于生态系统健康的纳米塑料水质基准理论与方法，研究低剂量、长期暴露和真实场景条件下，纳米塑料对水生生物的毒性效应和致毒机理，将其纳入人体健康水质基准研究，开展我国优先控制纳米塑料的水质基准与标准研究，提升国家新污染物治理、管理能力和国际履约能力。
在水生生态毒理学研究中，各种水生生物(如鱼类、水蚤、藻类等)被用于预测化学物质对水生环境可能产生的不利影响。而节肢动物占据了地球上各种生境的最大多样性(占整个现动物种数的80%)，在食物链中占据了能量和物质循环的重要生态位。其中，卤虫(Artemia sp.)作为世界广布的广盐性节肢动物的关键物种，承担着从基础生产者到高层捕食者的中间环节，在海洋生态系统的能量转换和物质流动中起着承上启下的关键作用。卤虫不仅在渔业饲养上的拥有重要地位(当前世界上85%以上的水产养殖动物的育苗均以其为饵料来源)，同时因其是一种典型的对饵料不加选择的滤食性动物，对环境有毒物质的刺激非常敏感，因此也成为研究抗逆机制的一种测试生物。综上，作为水生毒理学的生物学模型，使用卤虫有如下几个优点：1)相较于脊椎动物，人们对于无脊椎动物伦理的关注程度较低;2)卤虫已有较为全面的生物学和生态学背景知识;3)卤虫地理分布广泛，广布于咸水湖和池塘等水生环境中;4)对卤虫无节幼虫进行的测试既简单又经济高效;5)卤虫的无节幼虫由于体型小可以在小烧杯或培养皿中培养，对培养空间要求小，易于在实验室中评估;6)卤虫能够在广泛的水盐度和温度范围内适应和生存;7)卤虫的生命周期短这一特性使得它普适于生长、繁殖以及短期毒性测试验;8)卤虫卵是商业化的，因此可在全球范围内进行试验，且休眠卵在凉爽干燥的条件下可以储存数年而不失去活力，经海水中浸泡后，无节幼体可在约24 h内孵化使用;9)从卤虫卵中孵化出卤虫具有相似年龄、基因型和生理条件，适合作为毒理评价的同质性样本。
近年来，全球各地的研究人员纷纷采用卤虫作为水生纳米毒理学研究的试验生物。然而，目前缺乏标准化的卤虫水生毒性测试标准，导致这些研究所得出的数据可能缺乏可重复性和可靠性。通过本标准的实施，可规范新污染物纳米塑料水生毒性的科学评估，旨在最大限度地提高测试的可重复性和可靠性。适用的纳米塑料的主要成分包括且不仅仅包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚酯类(PET)、聚苯乙烯(PS)和聚酰胺(PA)等;适用的纳米塑料的形态包括且不仅仅包括纳米颗粒、纳米粉末、纳米纤维、纳米管、纳米线，以及此类聚集体和团聚体。该技术将为进一步建立适合我国国情和区域特点的纳米塑料内-外暴露风险评估模型，确定保护敏感人群健康的安全阈值，建立基于人体健康效应的CECs水质基准理论与方法提供指导作用。
本文旨在提供一个标准化的测试协议，以确保通过卤虫测试得出的水生毒性数据具有可靠性，进而为水体中的MNP的生态毒性评估提供依据。
四、编制过程
在编制过程中，充分考虑了标准的目的和必要性，对当前市场上已有的相关技术标准和应用进行调研，了解国内外在卤虫无节幼体的水生毒性试验及纳米塑料方面的最新进展和趋势最终形成了《基于卤虫无节幼体的纳米塑料水生毒性测定方法》标准编制具体如下：
1、前期准备工作
项目立项前，标准编制小组查阅、研读相关国内外文献，任务下达后，项目承担单位浙江树人学院于2023年7月中旬成立标准编制组。编制组成员对利用卤虫无节幼虫对纳米塑料进行水生毒性评估技术的有关内容分别进行了调研。同时，小组成员构思系统的框架及模块，进行系统建设需求分析。并与该领域的相关专家和用户进行调研、交流，广泛征求标准制定方面的意见和建议，以确保团体标准的科学性和实用性。
2、标准起草过程
团体标准立项通知公示后，标准编制小组首先组织了标注制定工作会议，各编写人员根据工作计划分工和编写要求开展了相关工作。在标准起草期间，编制小组主编单位及参编单位组织了数次内部研讨会和专家咨询会，经过多次修改，于2024年2月完成了标准初稿及编制说明的撰写⼯作。
3、工作计划
标准立项后计划6个月完成。
计划2023年8月提交标准初稿，2024年2月提交征求意见稿，2024年10月提交标准送审稿，2024年11月提交标准报批稿，2024年12月标准发布。
五、标准主要内容
本标准适用于测定纳米塑料水生毒性而进行的卤虫无节幼体的急性毒性和慢性毒性的试验，其他类型的纳米材料可参照使用。
1、主要架构
本标准按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，主要章节内容包括范围、规范性引用文件、术语和定义、 试验材料、试验设备、纳米塑料分散体的制备与表征、试验概述、数据分析、试验报告等。
2、主要技术内容
本标准规定了卤虫无节幼体的水生毒性试验及纳米塑料的术语和定义、试验概述、试验方法、数据处理与分析等的基本要求。
六、标准实施意义
1.环境保护与生态安全
随着塑料污染问题的日益严重，尤其是纳米塑料对水体生态系统的影响逐渐受到关注。通过建立基于卤虫无节幼体的毒性测定标准，可以更有效地评估纳米塑料对水生生物的潜在危害，从而为环境保护提供科学依据，促进水环境质量的改善。
2. 提高监测能力
卤虫无节幼体作为一种常用的水生生物模型，其快速繁殖和对环境变化敏感的特性使其成为理想的毒生物。在标准化测定方法的实施下，可以提高对水体中纳米塑料污染的监测能力，及时发现和评估水体污染风险。
3. 促进研究与技术进步
制定标准可以推动纳米塑料毒性研究的规范化和系统化，鼓励科研机构和企业在相关领域进行深入研究，推动新技术的开发和应用。同时，通过标准的实施，可以为后续的相关研究提供参考和基础数据，促进科学研究的进展。
4. 政策制定与法规遵循
标准化的毒性测定方法将为政府和相关管理部门制定环保政策和法规提供依据，确保水体资源的可持续利用。通过明确的标准，可以增强社会各界对塑料污染问题的重视，有助于形成全社会共同参与的环保氛围。
5. 提升公众意识
标准的实施有助于提高公众对纳米塑料污染及其对水生生态影响的认知。通过开展相关宣传教育活动，可以增强公众对环境保护的意识，鼓励与支持社会各界共同参与减少塑料使用和加强水体治理。
七、主要工程实践与产业化应用
(1)纳米塑料的类型及表征：
一般的，尺寸在100 nm范围内的塑料颗粒被定义为纳米塑料。纳米塑料根据世界主要的塑料分类，其成分主要为六种，包括聚乙烯(polyethylene，PE)、聚丙烯(polypropylene，PP)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)、聚苯乙烯(polystyrene，PS)、聚氨酯(polyurethane，PUR)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)。纳米塑料的生成机理与微塑料相似，包括应用于医药、化妆品、电子设备等行业的塑料因风化等作用进行初级和次级降解，汇集在工业和生活污水中后，最终排放到水生环境中。目前，因纳米塑料在基质中的分辨率很低，故对其分离、定量和测量的方法还很少。本标准采用纳米颗粒跟踪分析法(nanoparticle tracking analysis，NTA)来确定测试样品中的纳米塑料尺寸分布，其适用于尺寸范围为30~2000 nm的塑料颗粒;而后使用紫外-可见光谱法(ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis)、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)、能谱(energy dispersive spectroscopy，EDS)、场流散射(field flow fractionation，FFF)和动态光散射(dynamic light scattering，DLS)对纳米塑料进行进一步的构象测试。
(2)卤虫的物种鉴别及生理特性：
卤虫从物种上主要包括Artemia franciscana、A. salina和A. parthenogenetica三种。其中，A. parthenogenetica来自四个独立的物种起源的杂合，由于物种敏感性的差异和分类学的不精确性，不建议使用A. parthenogenetica进行生态毒理学测试。在本标准中，我们采用培养参数更广谱化的A. salina作为卤虫生物模型进行纳米塑料的水生毒性评估，以实现研究的标准化。依据卤虫发育途径的生物学特点，给予适宜孵化条件(盐度20‰、温度27℃、pH值8.5、光照1000 lux)，将经过镜检筛选、处于休眠状态的卤虫卵在短时间内孵育出无节幼虫。卤虫的生长分为四个阶段：I龄期(孵化后24 h内，无节幼体冲破卵膜成“挂灯笼”状形态)、II龄期(孵化后24~48 h，无节幼虫)、Ⅲ龄期(孵化后2~10天，无节幼虫)和成虫期(孵化10天后)(图1)。II龄期无节幼虫是毒理暴露使用最多的发育阶段，在此期间卤虫形成了较为成熟的胃肠道，肠上皮与外部环境直接接触，有助于摄取纳米塑料;且该生长时期的幼虫容易保养，对各种毒物敏感、靶点广泛，能够客观地反映被测试样与生物机体作用的相关性，是本标准水生毒性测试采用的最佳龄期。
图1 卤虫孵化在0-96 h的形态特征(×40)
(3)毒理实验的暴露时间：
卤虫II龄期无节幼虫对MNPs的暴露时间从5分钟到45天不等，主要分为短期暴露和长期暴露两类毒理试验。短期试验的暴露时间范围为5分钟至96小时，其中24小时和48小时是最常用的暴露时长。长期试验则选用了14天、30天、44天和45天的暴露时间。短期测试(≤96小时)是目前使用最广泛且已建立较完善的毒理学测试方法;而长期测试(通常为7至14天)的使用量在过去十年中逐渐增加。关于短期测试，24 h暴露测试的应用最为普遍，其所得结果更为均质，操作简单易行;而从技术角度来看，无需使用复杂设备或高度训练的专业人员。长期测试对于深入了解受试生物对污染物的敏感性至关重要。这类研究能够揭示短期测试中难以观察到的毒性效应，更贴近现实环境场景，能够全面评估污染物在生物整个生命周期中的慢性影响。例如，长期暴露于聚苯乙烯纳米粒子对卤虫产生明显的毒性作用，而这一点在短期测试中并未体现。关于长期测试，14天暴露测试的应用最为普遍，其所得结果更为均质。因此，强调在研究中应尽可能兼顾评估MNPs急性毒性小叶(短期暴露)和慢性毒性效应(短期暴露)，显得尤为关键。
(4)毒性参数分析及评价方法：
在MNPs对卤虫产生的主要毒性作用中，主要包括死亡率/活动能力丧失、发育/生长改变、生化指标变化、基因表达改变以及肠道损伤。除死亡率/活动能力丧失这一指标外，其他效应的标准化代表性较弱，故本标准仅选择死亡率/活动能力丧失作为卤虫水生毒性指标。具体评价方法如下：
①镜检鉴别
购回的卤虫卵打开包装后，优质卵有一股新鲜的虾腥味;卵的颜色为棕褐色、有光泽;比较松散，无潮湿感，手抓少许握紧，不成团而顺手指缝流下。凡是潮湿发霉、有腥臭味、光泽黯淡、手抓少许成团不散、潮湿感较强的，都不得使用。将待选的卤虫卵用饱和盐水洗去沙粒等杂质(沙粒、泥沙等杂质沉于饱和盐水底部，卤虫卵浮于液面)，淡水洗去空壳(空卵浮于淡水液面，优质卵则沉于淡水底部)，20℃烘干后，置冰箱4℃干燥保存备用。取适量干燥好的完好、健康卵粒于低倍镜下观测。一般优质卵像踩瘪的乒乓球，若卤虫卵呈圆形则视为湿卵或空卵;观察卵壳外的附着物，有无结晶状物质，一般来讲，质量好的卵外壳的结品物或其他杂质少，否则说明卵在加工过程中未经清洗或沉淀处理;另外，卤虫卵不能有破损。
②卤虫孵化及优选
孵化前，将卤虫卵平摊于大培养皿中，在通风干燥向阳的地方，自然光刺激下曝光2×24 h。将人工海盐溶解于1000 mL的蒸馏水中，配制成20‰的人工海水，并用适量小苏打(NaHCO3)调节pH至8.5左右。将经镜选、预照后的优质卵适量放入小培养皿中，加入配制好的人工海水;水浴温度控制在27℃;灯泡或灯管从侧面照明，光照强度1000 lux。24 h后该卵即孵化为实验所需的II龄期卤虫无节幼虫。优选出不易下沉、活力较强、体色较红、运动正常(附肢划水，虫体向前泳动，有时上下翻滚，泳动频率一般每秒为4次左右)的优质卤虫，备用。
③待测样品的配制
MNPs用的20‰人工海水配制成相应浓度，并用适量小苏打(NaHCO3)调节pH至8.5左右即可。
④毒性评估
按空白对照组、阳性对照组和MNPs样品组各设3~5个平行，空白对照组仅加入20‰的人工海水，样品组则由待测样品按③配置而成，阳性对照组加标准浓度的试液;每个测试样品按需要设置终浓度;每组分别加入优选得到的10个同步生长的优质卤虫，以确保样品浓度的稳定和卤虫生存环境的一致。长期暴露实验为保证卤虫生长，可每天分别两次投喂小球藻(Chlorella，密度为105 cells/mL)，每3天换一次人工海水。
根据短期暴露(24 h)和长期暴露(14天)两类毒理试验的需要，饲毒响应时长后，观察卤虫运动的变化，主要包括以下5钟情况：死亡，活动能力丧失;沉底，偶有滑动;泳动迟缓，每秒1~2次;泳动缓慢，每秒约3次;运动加快呈逃避反应。本模型以卤虫死亡/活动能力丧失为毒性判断标准，卤虫毒性评估用存活率及校正死亡率表示，按以下公式计算：
存活率=存活个体数/总个体数×100%
校正死亡率=(对照组存活率-处理组存活率)/对照组存活率×100%
将各个浓度及其对应的校正死亡率输入计算机，计算LC50(校正死亡率为50%时的MNPs浓度)及其95%置信区间，从而得到具统计学意义的可比较的毒性强度。
(5)MNPs短期暴露(24 h)对卤虫的毒性评估：
将经镜选、预照后的优质卤虫卵在标准条件下孵化，将0.500 g卵放入锥形玻璃孵化管中，加入盐度为20‰人工海水200 mL(pH调至约8.5)，底部持续充气，日光灯持续光源1000 lux，水温27℃。孵化24 h后停气，静置5 min后使卵壳、未孵化的卤虫卵和卤虫无节幼体分离，收集无节幼体。
选取100只个体大小均匀的幼体转移至添加200 mL 20‰人工海水的锥形玻璃养殖管中，密度为0.5 ind./mL。向养殖管中加入选取直径为100 nm的荧光聚苯乙烯纳米塑料(Polystyrene Nanoplastics，PSNPs)(浓度分别为0.05、0.5、5和10 μg/mL)，每组3个平行。24 h后测定卤虫存活率，并从每管取出5只卤虫，放置体视显微镜下，使用绿色荧光(荧光PSNPs最大激发波长和发射波长分别为488 nm和518 nm)观察纳米塑料被卤虫摄取的情况。
卤虫在不同浓度PSNPs中暴露24 h后，带有绿色荧光的PSNPs在卤虫肠道部分发生较强的荧光信号，表明PSNPs被卤虫摄食并聚集在卤虫肠道内。在PSNPs 5 μg/mL和10 μg/mL组中明显观察到卤虫不仅将PSNPs摄食到体内，并以粪球的形式排出体外(图2)。结果表明，聚集在养殖水体中的PSNPs聚合物能够被卤虫摄食到肠道内，并大部分PSNPs会以粪球的形式排出体外。
除在最高PSNPs浓度(10 μg/mL)下短期暴露24 h后，幼体周围出现蜕皮和PSNPs聚集物，校正死亡率达13.3±3.4%，具有显著性差异外(p<0.05);PSNPs在0.05、0.5和5 μg/mL浓度下，校正死亡率分别为1.0±0.2%、1.3±0.1%和2.1±0.7%，并无显著性差异(p>0.05)。
(6)MNPs长期暴露(14 d)对卤虫的毒性评估：
将经镜选、预照后的优质卤虫卵在标准条件下孵化，将0.500 g卵放入锥形玻璃孵化管中，加入盐度为20‰人工海水200 mL(pH调至约8.5)，底部持续充气，日光灯持续光源1000 lux，水温27℃。孵化24 h后停气，静置5 min后使卵壳、未孵化的卤虫卵和卤虫无节幼体分离，收集无节幼体。
选取100只个体大小均匀的幼体转移至添加200 mL 20‰人工海水的锥形玻璃养殖管中，密度为0.5 ind./mL。向养殖管中加入选取直径为100 nm的荧光聚苯乙烯纳米塑料(Polystyrene Nanoplastics，PSNPs)(浓度分别为0.05、0.5、5和10 μg/mL)，每组3个平行。养殖管放入水箱中27℃恒温养殖，每天两次(间隔12 h)投喂小球藻(Chlorella，密度为105 cells/mL)，每3天换一次水，14天后测定卤虫校正死亡率。
长期暴露(14 d)于0.05、0.5、5和10 μg/mL PSNPs对存活率有显著影响(p<0.05)，且暴露组和对照组之间存在显著差异(p<0.05)。在测试的最高浓度10 μg/mL下，矫正死亡率高达100%;PSNPs在0.05、0.5和5 μg/mL浓度下，校正死亡率分别为36.0±2.7%、61.8±3.2%和82.6±5.1%。随着发育(直到14天)，在形态学水平上，暴露于0.5 μg/mL及以上浓度的PSNPs下，3天检测到发育改变(图3);在14天后，一些暴露于5和10 μg/mL的幼体发育仍停留在II龄期，而没有进展到III龄期。
注：上排图片-暴露3 d后的形态变化，下排图片-暴露14 d后的形态变化
八、小结
《基于卤虫无节幼体的纳米塑料水生毒性测定方法》的制定与实施，不仅为水环境保护提供了科学依据，也为生态安全监测、政策制定和公众教育等方面带来了积极影响。实施这一标准将有助于全面应对塑料污染带来的挑战，促进水生生态系统的可持续发展。
